HPLC法测定头孢克肟片中的有关物质
满彦汝，董娟、刘姣、程宁宁，沈运朋
（山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁 272100）
摘要：目的建立一种高效液相色谱法，用于测定头孢克肟片中的有关物质。方法采用Welch XB C18色谱柱 （4.0×125mm,5μm），四丁基氢氧化铵溶液：乙腈（75:25）为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序；柱温为40℃；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL/min。 结果该方法专属性良好，头孢克肟与各杂质峰之间的分离度良好，在各自浓度范围内，头孢克肟及5种杂质溶液浓度和峰面积呈良好的线性关系（r≥0.9999）；定量限、检出限、耐用性等均符合要求。结论该方法可简便、快速、有效检出头孢克肟片中有关物质。
关键词：头孢克肟片；有关物质；高效液相色谱法
Determination of related substances in cefixime tablets by HPLC
Man Yanru,Dong Juan,Liu Jiao,Cheng Ningning,Shen Yunpeng
(Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Jining 272100, China)
Abstract: Objective To establish a HPLC method for the determination of related substances in cefixime tablets. Methods The analytical column was Welch XB C18（4.0×125mm,5μm）; Mobile phase A wastetrabutylammonium hudroxide solution-acetontrile (75:25), mobile phase B was acetonitrile，gradient elution. The column temperature was 40℃, the detective wavelength was 254nm, and the flow rate was about 1.0mL/min. Results The method had good specificity, and the separation degree between cefixime and each impurity peak is fine. In the respective concentration range, the concentration of cefixime and 5 impurity solutions has a good linear relationship with the peak area (r≥0.9999). Quantitative limits, detection limits, durability, etc. all meet the requirements.Conclusion The method is simple, rapid and effective for the detection of related substances in cefixime tablets .
Key Words: Cefixime tablets; The related substances; HPLC
头孢克肟是第三代头孢菌素，具有抗菌谱广，半衰期长，交叉耐用性小等特点，对部分革兰氏阳性菌及阴性菌均具有抗菌活性，对各种细菌产生的β-内酰胺酶具有较强的稳定性[1-3]。头孢克肟的口服制剂应用广泛，包含片剂、胶囊剂、颗粒剂等多种剂型。
查阅各国药典及相关文献[4-11]发现，英国药典仅收载了头孢克肟原料药的质量标准，美国药典、日本药典和中国药典均收载了头孢克肟原料药及制剂质量标准。其中，美国药典收载的片剂标准中未对有关物质进行控制；中国药典片剂标准采用等度洗脱的方法，控制有关物质的单杂和总杂，未对特定杂质进行控制。经对比，国内外药典收载的头孢克肟质量标准中有关物质的检测方法均是高效液相色谱法，色谱条件基本一致，流动相均采用四丁基氢氧化铵溶液-乙腈体系，仅四丁基氢氧化铵溶液浓度及有机相比例略有差异，均使用等度洗脱的方法，使用主成分自身对照法计算单杂和总杂。本论文中建立了头孢克肟片有关物质的检测方法，采用梯度洗脱的方法，试验结果表明该方法准确度高、专属性强、灵敏度高，可以有效检测出头孢克肟片中5种特定杂质。
1 仪器与材料
1.1仪器
岛津LC-20AT（美国Shimadzu公司）；METTLET TOLEDO XSE205电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）；METTLET TOLEDO MSA6.6S-OCE-DM电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）；METTLET TOLEDO Seven Excellence pH计（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）。
1.2材料
头孢克肟对照品（来源：浙江普洛得邦制药有限公司，批号：GAP091-1805-2002，含量：89.6%）；杂质A对照品[来源：SINCO，批号：18-10-2656，含量：97.68%。杂质A有2个手性中心，具有四个异构体（A1、A2、A3、A4）含量分别为A1占50%、A2占25%、A3占10%、A4占15%，对杂质A1和A2进行研究]；杂质B对照品[来源：TLC，批号：2757-021A11，含量：99.2%。杂质B为外消旋异构体（B1、B2二者含量比约为1：1），二者无法达到基线分离]；杂质C对照品（来源：SINCO，批号：17-11-1008，含量：97.99%）；杂质D对照品（来源：TLC，批号：2235-089A6，含量：97.1%）；杂质E对照品（来源：TLC，批号：3072-002A2，含量：98.7%）；头孢克肟甲酯对照品（来源：TLC，批号：2405-056A6，含量：96.7%）；头孢克肟及各杂质结构式见图1。某公司生产的三批样品（批号：Y51210801~Y51210803）；乙腈（色谱纯，Fisher）；四丁基氢氧化铵（麦克林，分析纯）；磷酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；水（屈臣氏，超纯水）。
头孢克肟 杂质A
杂质B 杂质C
杂质D 杂质E
图1 头孢克肟及各杂质的化学结构式
Fig. 1 Chemical structure formula of cefixime and other impurities
2测定方法
2.1色谱条件
色谱柱：Welch XB C18 （4.0*125mm ，5μm）
流动相A：四丁基氢氧化铵溶液[取40%四丁基氢氧化铵溶液20.5ml(约相当于四丁基氢氧化铵8.2g)，置于800ml水中，用磷酸调节pH值至6.5，再用水稀释至1000ml]-乙腈（75:25）；流动相B：乙腈
柱温：40℃，样品室温度：8℃ 检测波长：254nm，流速：1.0ml/min，进样体积：10μL。
洗脱梯度如下表：
时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
0 | 100 | 0 |
20 | 100 | 0 |
35 | 70 | 30 |
50 | 70 | 30 |
55 | 100 | 0 |
60 | 100 | 0 |
2.2 溶液的制备
空白溶剂：流动相A
系统适用性溶液：取头孢克肟对照品约10mg，精密称定，加水约10ml，于沸水浴上加热45分钟，冷却。
供试品溶液：取头孢克肟片10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于头孢克肟25mg），置25ml量瓶中，加溶剂适量，超声并振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
各杂质对照品储备液：分别称取杂质A、B、C、D、E对照品约10mg，精密称定，置不同10ml量瓶中，加乙腈适量使溶解并用溶剂稀释至刻度，摇匀。（若无法溶解可超声助溶）。
各杂质定位溶液：精密量取各杂质对照品储备液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
混合溶液：精密称定细粉适量（约相当于头孢克肟10mg），置10ml量瓶中，精密加入各杂质对照储备溶液1ml，超声并振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
2.3 分析方法的选择
将杂质定位溶液和混合溶液分别在中国药典、英国药典和自拟方法条件下进行进样。在中国药典色谱条件下，混合对照溶液中，杂质A与杂质C、杂质D与头孢克肟间均无法有效分离，主要降解杂质与相邻杂质峰之间的分离效果较差。在英国药典色谱条件下，混合对照溶液中与中国药典相比，各杂质出峰顺序未发生改变；杂质A的峰型明显改善，头孢克肟与相邻杂质峰之间均可有效分离；但杂质B与杂质E之间分离效果较差。自拟方法在英国药典的基础上，将等度洗脱调整为梯度洗脱，混合对照溶液中，各杂质与主峰之间均可有效分离，各降解杂质（杂质A、杂质B、杂质C、杂质D）与相邻峰均可有效分离。由供试品溶液检测结果说明，该色谱条件可以有效检出未知杂质。
3方法学考察
3.1专属性-强制降解试验
将空白溶剂、空白辅料和供试品分别在1mol/L的盐酸溶液破坏24h（强酸破坏）、0.2mol/L的氢氧化钠溶液破坏1h（强碱破坏）、30%过氧化氢溶液破坏1h（氧化破坏）、70℃加热2h（高温破坏）、4500lx±500lx破坏48h（光照破坏）和太阳光破坏1天（太阳光破坏），结果表明，本品在强酸、强碱、氧化、高温、光照破坏条件下，主峰与相邻杂质峰之间分离度最小值为1.90，辅料峰不干扰杂质及主峰的测定。各降解条件下的供试品溶液中，主峰为纯峰，物料回收率均在90%~110%，物料守恒。
3.2专属性-杂质定位试验
将空白溶剂、系统适用性溶液、各杂质对照品定位溶液、混合溶液分别进样。结果表明，在该色谱条件下，空白溶剂不干扰测定，系统适用性溶液色谱图中，杂质D与头孢克肟之间分离度符合要求，混合溶液色谱图中，杂质B（B1、B2）、杂质E、杂质D、头孢克肟、杂质A（A1、A2、A3、A4）、杂质C依次出峰，各杂质与主峰之间均可有效分离，杂质B1、B2互为异构，其保留时间临近，存在重合的可能，因此，为了保证制剂产品的质量，在标准中对B1、B2进行合并计算。验证结果符合规定。混合溶液色谱图见图2。
图2 混合溶液图谱
Fig. 2 Chromatograms of mixed solution
3.2定量限与检测限
定量限溶液（S/N≥10）连续进样6针，各峰保留时间的RSD均小于2.0%；峰面积的RSD均小于5%。检测限溶液中各峰的S/N均大于3。结果表明该方法可有效检出各杂质。结果见表1。
表1 线性与范围及定量限(LOQ) 与检测限(LOD) 结果
Tab. 1 Results of linearity and range, Limit of quantification (LOQ) and Limit of detection (LOD)
杂质 | 线性方程 | 线性范围 /μg·mL-1 | r | 定量限 | 检测线 | ||
μg·mL-1 | 占供试品百分比（%） | μg·mL-1 | 占供试品百分比（%） | ||||
头孢克肟 | Y=20668.69X-401.62 | 0.3594-12.5791 | 0.9999 | 0.3581 | 0.04 | 0.1074 | 0.01 |
杂质A1 | Y=13454.88X-251.58 | 0.3634-12.7191 | 0.9999 | 0.3634 | 0.04 | 0.1090 | 0.01 |
杂质A2 | Y=13438.37X-93.51 | 0.1952-6.8321 | 0.9999 | 0.1952 | 0.02 | 0.0586 | 0.006 |
杂质B1 | Y=15436.14X-285.69 | 0.4714-16.4989 | 1.0000 | 0.4714 | 0.04 | 0.1414 | 0.01 |
杂质B2 | Y=15624.85X-3.96 | 0.3047-10.6660 | 0.9999 | 0.3074 | 0.04 | 0.0922 | 0.01 |
杂质D | Y=19903.97X-390.25 | 0.3891-13.6200 | 0.9999 | 0.3891 | 0.04 | 0.1167 | 0.01 |
杂质E | Y=22008.95X-573.83 | 0.4002-14.0056 | 0.9999 | 0.4002 | 0.04 | 0.1201 | 0.01 |
3.3对照品溶液线性关系与范围、校正因子
在浓度的定量限至限度浓度140%范围内，取多个浓度点，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，将头孢克肟及各杂质对照品进行线性回归。结果表明，在上述范围内头孢克肟及各杂质，浓度与峰面积线性相关系数均大于0.9999，表明头孢克肟及各有关物质在该方法条件下线性良好。头孢克肟及各杂质回归方程见表1。
杂质D、杂质E的校正因子在0.9~1.1范围内，因此，可采用不加校正因子的自身对照法计算杂质含量；杂质A1和 A2的校正因子约为1.46、杂质B1和B2的校正因子分别为1.27和1.25，校正因子大于1.1。现各国药典均未对已知杂质进行单独控制，中国片剂标准标准中单个杂质的限度为1.0%，且考虑到杂质A、杂质B均为消旋体，合成的难度相对较大，杂质的含量也不受控制（USP、EP、中检所均不供应杂质对照品），会对校正因子产生一定的影响，综合考虑暂不对杂质进行校正，均按照不加校正因子的自身对照法计算杂质含量。
3.3精密度试验
3.4.1重复性
重复性是通过配制6份供试品溶液、对照溶液来验证该方法具有良好的精密度。结果表明6份供试品溶液中，按自身对照法计算，杂质D检出量小于0.05%，不予比较；杂质A1、杂质A2、杂质B1及B2的和、杂质E、其他最大单杂、总杂的RSD分别为2.29%、1.91%、2.63%、1.68%、1.32%、1.43%；均符合规定，方法重复性良好。
3.4.2中间精密度
另一名分析人员于不同日期、不同仪器进行中间精密度试验。结果表明6份供试品溶液中，按自身对照法计算，杂质D检出量小于0.05%，不予比较；杂质A1、杂质A2、杂质B1及B2的和、杂质E、其他最大单杂、总杂的RSD分别为0.53%、1.05%、2.77%、0.80%、8.40%、0.98%；均符合规定，方法中间精密度良好。12份供试品溶液中，按自身对照法计算，杂质D检出量小于0.05%不予比较；杂质A1、杂质A2、杂质B1及B2的和、杂质E、其他最大单杂、总杂的RSD分别为2.15%、5.15%、9.86%、1.48%、10.03%、3.16%；均符合规定，精密度良好。
3.5溶液稳定性试验
为了考察溶液稳定性，将供试品溶液及自身对照溶液，在低温8℃条件下放置48h。试验结果表明：在8℃条件下放置48h，对照溶液主峰峰面积变化率最大为2.57%，小于10%；供试品溶液杂质D检出量小于0.05%，不予比较；杂质A1、杂质A2、杂质B1与B2和、杂质E、其他最大单杂检出量均在0.05%~0.5%之间，杂质最大变化率分别为6.30%、14.61%、9.64%、15.60%、3.12%，均小于20%，总杂检出量在0.5%~5%之间，杂质量变化率为4.47%，小于10%；且没有新的大于报告限度的色谱峰出现，因此，对照溶液及供试品溶液8℃条件下48h溶液稳定性良好。
3.6准确度试验
各杂质在限度浓度为50%、100%、150%下的平均回收率在85.26%～105.19%范围内，各杂质在不同浓度下回收率的RSD在1.17%~5.15%范围内，回收率具体数据见表2。
表2 加样回收率试验结果
Tab. 2 Test results of recovery rate of added sample
名称 | 低浓度/% | 中浓度/% | 高浓度/% | RSD/% | ||||||
杂质A1 | 97.82 | 91.45 | 94.19 | 94.59 | 95.77 | 91.45 | 89.77 | 94.73 | 87.42 | 3.49 |
杂质A2 | 98.68 | 92.12 | 94.32 | 93.54 | 94.78 | 89.91 | 87.73 | 86.57 | 85.26 | 4.82 |
杂质B1 | 108.42 | 98.37 | 105.19 | 103.37 | 105.01 | 102.1 | 93.65 | 95.53 | 95.63 | 5.15 |
杂质B2 | 100.83 | 97.12 | 99.4 | 100.46 | 101.08 | 99.67 | 102.29 | 104.27 | 103.86 | 2.23 |
杂质D | 100.56 | 98.95 | 98.42 | 96.91 | 97.18 | 97.34 | 97.81 | 98.1 | 99.05 | 1.17 |
杂质E | 103.76 | 102.49 | 101.54 | 100.42 | 101.05 | 101.26 | 103.2 | 103.92 | 103.93 | 1.34 |
3.7耐用性
通过流速变化±0.2ml/min、波长变化±5nm、pH变化-0.2、有机相比例变化+2%、离子对试剂变化-2ml、色谱柱温度变化±2℃、更换色谱柱，除杂质B1、B2峰出现合并之外，其他杂质均可有效分离，对杂质的归属和计算不会产生影响；pH变化+0.2、有机相变化-2%、离子对试剂变化+2ml时，杂质B2、杂质E无法分离，影响到杂质的归属和计算。因此，在检测过程中需要严格控制pH、有机相比例及离子对试剂浓度，要求操作的规范性。在保证操作规范性的前提下，检测仪器参数微小变化及相同品牌、型号色谱柱的变更对检测结果无明显影响，该方法耐用性良好。
3.8特定杂质（A1、A2、B1、B2、D、E）相对保留时间
经过耐用性试验，在杂质B与杂质E可有效分离的条件下，对混合对照溶液中杂质A1、A2、B1、B2、D、E的相对保留时间进行统计，各杂质相对保留时间最大差值为0.04，最小差值为0.01，无明显差异。为了对样品进行更好的检测，确定了各杂质的相对保留时间。
杂质名称 | 相对保留时间 |
杂质B1 | 0.62 |
杂质B2 | 0.64 |
杂质E | 0.69 |
杂质D | 0.88 |
杂质A1 | 1.21 |
杂质A2 | 1.31 |
3.9样品检测
采用上述检测方法，对某公司生产的3批头孢克肟片样品进行检测。采用不加校正因子的主成分外标法对有关物质进行计算。检测结果见表3，检测结果均符合质量标准。
表3 头孢克肟片有关物质检测结果
Tab. 3 Test results of related substances in Cefixime tablets
| 检出量/% | ||
批号 | Y51210801 | Y51210802 | Y51210803 |
杂质A1 | 0.17 | 0.17 | 0.18 |
杂质A2 | 0.04 | 0.04 | 0.04 |
杂质B1、B2和 | 0.05 | 0.10 | 0.04 |
杂质D | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
杂质E | 0.10 | 0.11 | 0.11 |
其他单个杂质 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
总杂 | 0.51 | 0.57 | 0.49 |
注：“/”表示未检出。
4 讨论
本论文中参考了各国药典中头孢克肟有关物质的检测方法。通过对色谱条件的优化，建立梯度洗脱的方法，最终确定头孢克肟片有关物质的检测方法，能有效检测各种杂质。在有关物质限度的制定过程中，结合强制降解及稳定性放置过程中杂质的增长情况，根据多批次参比制剂有关物质检测结果，对特定降解杂质进行归属，将杂质A1、杂质A2、杂质B1及B2的和、杂质D、杂质E作为特定杂质定入质量标准，结合参比制剂的检出情况以及中国药典限度拟定单杂和总杂的限度，并对3批样品进行检测。结果表明3批样品中各已知杂质、单杂和总杂含量均低于限度，符合检测要求。综上所述，该方法专属性强；灵敏度高；准确度好；结果可靠，适用于头孢克肟片中有关物质的检测。
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